لماذا تفشل WB التجريبي باستمرار؟ تحقق من الأسباب التالية!

اليوم ، دعنا نتحدث عن المشكلة التي تسببت في عدد لا يحصى من زملاء البحث في تجربة الصداع - لطخة غربية (WB). هذه تبدو بسيطة ولكن مليئة بتجربة "الفخاخ" ، لماذا تجعلنا دائمًا نتعثر مرارًا وتكرارًا؟ الآن دعنا نراجع أسباب الفشل معًا.

I. لا فرق

قد تشمل الأسباب المحتملة:

1. مشكلات الأجسام المضادة: قد يكون الجسم المضاد غير فعال أو غير محدد أو غير ملزم للبروتين المستهدف.
2. مشكلات العينة: قد تحتوي العينة على مواد متداخلة ، أو تكون منخفضة التركيز ، أو تدهورت بالفعل.
3. المشكلات الكهربائية: ظروف الكهربائي غير المناسبة ، مثل الجهد أو الوقت أو الاستخدام غير السليم للمخزن المؤقت.
4. مشكلات النقل: المشكلات أثناء عملية النقل ، مثل اختيار الغشاء غير المناسب ، وقت النقل ، أو المخزن المؤقت للنقل.
5. المشكلات الحظر: قد يكون حل الحظر غير مناسب أو قد يكون وقت الحظر طويلًا جدًا.
6. مشكلات تلطيخ: قد يتم انتهاء صلاحية كاشف تلطيخ أو غير حساس أو مستخدم بشكل غير صحيح.

مشكلات المعدات: قد يتم معايرة المعدات أو لا يتم معايرة بشكل صحيح.

1. مشكلات التشغيل التجريبية: قد لا تكون العملية التجريبية موحدة ، مثل عدم كفاية الغسيل أو تحميل العينة غير المتكافئ.
2. مشكلات تعديل البروتين: قد يخضع البروتين المستهدف إلى تعديلات ما بعد التحويلية التي تمنع التعرف على الأجسام المضادة.
3. مشكلات تعبير البروتين المستهدفة: قد يكون للبروتين المستهدف تعبيرًا منخفضًا جدًا أو لا يوجد تعبير في الخلايا أو الأنسجة التي يتم اكتشافها.

الثاني. خلفية عالية

قد تشمل الأسباب المحتملة:

1. تركيز الأجسام المضادة العالية: قد يؤدي استخدام الكثير من الأجسام المضادة إلى زيادة الربط غير المحدد ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
2. مشكلات جودة الأجسام المضادة: قد يكون للجسم المضاد ربط غير محدد أو مفاعل مع بروتينات أخرى.
3. عدم كفاية الحظر: فشل حل الحظر في تغطية مواقع الربط غير المحددة بشكل فعال على الغشاء ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
4. قضايا الغشاء: قد يكون للغشاء رديء جودة أو تلوث ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
5. النقل غير المكتمل: أثناء عملية النقل ، قد لا يتم نقل البروتينات بالكامل إلى الغشاء ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
6. الغسيل غير الكافي: تفشل خطوات الغسيل في إزالة الأجسام المضادة غير المحدودة أو غيرها بفعالية ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
7. قضايا تلطيخ الكاشف: قد يكون كاشف تلطيخ حساسًا أو غير مستقر للغاية ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
8. مشكلات المعدات التجريبية: قد يكون للمعدات تسرب أو تداخل ، مما يؤدي إلى خلفية عالية.
9. مشكلات عينة البروتين: قد تحتوي العينة على كمية كبيرة من المواد المتداخلة ، مثل منتجات تدهور البروتين أو الشوائب الأخرى.
10. مشكلات التشغيل التجريبية: قد لا تكون العملية التجريبية موحدة ، مثل وقت الحضانة المطول أو ارتفاع درجة الحرارة.

ثالثا. نطاقات غير محددة أو أحجام نطاقات البروتين غير صحيحة

قد تشمل الأسباب المحتملة:

1. الكثير من مقاطع الخلايا ، مما يؤدي إلى مستويات تعبير بروتين مختلفة ، مما يؤدي إلى أحجام النطاق غير المتسقة أو وجود نطاقات متعددة.
2. تدهور عينة البروتين ، مما يؤدي إلى انخفاض الوزن الجزيئي للبروتين أو وجود نطاقات متعددة.
3. في الجسم الحي ، قد يكون للعينات البروتينية المعبر عنها أشكالًا مختلفة من التعديلات مثل الأسيتيل ، والميثيل ، والألكلة ، والفسفرة ، والغليكوزيل ، مما يؤدي إلى أحجام النطاق غير المتسقة أو وجود نطاقات متعددة.
4. يحتوي البروتين المستهدف على أشكال isoforms متعددة أو متغيرات لصق ، مما يؤدي إلى أحجام النطاق غير المتسقة أو وجود نطاقات متعددة.